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成功案例-微塑料如何影响人体健康肠道菌群全长
来源:未知    发布时间:2022-04-16    浏览[]次

  原标题:成功案例-微塑料如何影响人体健康,肠道菌群全长16S+代谢组联合分析解开奥秘

  中文题目:聚苯乙烯微型/纳米塑料通过肠道微生物群、代谢物和细胞因子的相互作用诱导造血损伤

  微型/纳米塑料(MNPLs)是尺寸分别小于5mm和小于0.1μm的塑料纤维、颗粒或薄膜,人类生活环境和日常生活必需品,是一种新型的环境污染物,广泛存在于环境和生命中且极难降解,给人类健康带来危害。之前的研究表明,MNPLs可以在消化系统、肝脏和肺中积累,从而导致各种病理过程,如能量平衡失衡、代谢紊乱等。然而,关于MNPLs对其他系统毒性的研究仍然缺乏,迫切需要系统地探索MNPLs对人体的潜在毒性效应。已有研究报道NMPLs可以穿透骨髓,影响骨髓细胞基因表达,引起血液学参数的变化。肠道微生物群已被认为是导致MNPLs诱导毒性发生和发展的关键因素,并与血液学参数的变化有关。肠道微生物群通过微生物代谢物影响宿主健康,代谢物可以通过多种机制发挥炎症抑制功能,如多胺代谢和SCFA(短链脂肪酸)信号分子。然而,肠道微生物群、代谢物和细胞因子在MNPLs诱导血液毒性过程中的作用以及它们之间的相互作用尚未明确。

  本文旨在阐明MNPLs引起的造血损伤,并结合高通量16S rRNA基因测序、代谢组学分析和细胞因子芯片分析肠道微生物群-代谢物-细胞因子轴在MNPLs诱导血液毒性中的作用。为微型/纳米塑料(10μm、5μm和80 nm)可导致血液毒性提供了证据,解开了围绕潜在机制的一些谜团,并为后期治疗奠定了基础。

  实验材料:四周龄C57BL/6J雄鼠;聚苯乙烯微型/纳米塑料荧光微球(PS-MNPLs)

  实验方法:血常规,苏木精和伊红(HE)染色,集落克隆实验,流式分选,16S rRNA基因全长测序,代谢组学,细胞因子芯片

  作者用C57BL/6J小鼠以60μg剂量灌胃给予PS MNPLs(10μm,5μm和80 nm)42天,对照组给予0.25ml纯水,每日1次。期间每周进行称重。

  与对照组相比,10μm、5μm和80 nm MNPLs处理组的小鼠体重降低,但没有显著差异(图1A)。10μm PS MNPLs处理组(MP-10)和5μm PS MNPLs处理组(MP-5)的脾脏相对重量显著降低(图1B)。与对照组相比,其他器官没有变化(图1 C-G)。这一结果表明,MNPLs处理可能导致小鼠体重降低,免疫相关器官的内脏比率显著改变,导致免疫系统损伤。

  使用HE染色对骨髓组织进行病理学检查。结果表明,PS-MNPLs处理导致骨髓细胞稀疏、无序,脂滴增多(图2A)。与对照组相比,研究中小鼠脾脏的器官系数发生了显著改变。脾脏红髓和白髓中有核细胞增多,细胞核染色加深。

  测定了造血干细胞(HSC)的集落形成、再生和分化能力。PS-MNPLs处理影响集落生长,集落稀少且分散(图2B)。

  观察结果表明,在所有三个PS-MNPLs暴露组中,爆发性红细胞形成单位(BFU-E)、粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)和粒细胞-红细胞-单核细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GEMM)急剧下降(图2C)。BFU-E是最早确定的红系祖细胞群,集落分析有助于描述红细胞生成;CFU-GM 水平的下降与中性粒细胞减少症的持续时间显著相关;CFU-GEMM,这是一种具有多能干细胞特性的造血祖细胞,可产生包含粒细胞、红细胞、单核巨噬细胞和巨核细胞成分的混合造血细胞群。本研究结果表明,MNPLs 影响造血干细胞 (HSCs) 的增殖和分化,并阻碍红细胞生成。

  造血是一个高度调节和复杂的过程,涉及造血干细胞(HSC)和骨髓中造血生态位的细胞。在造血系统的顶端是长期重组造血干细胞(LT-HSCs),它们可以进行定向对称分裂以产生短期造血干细胞(ST-HSCs)。HSC存在于骨髓中的Lin-/Sca-1+/c-Kit+(LSK)部分,HSCs同时产生多能祖细胞(MPPs)的所有亚群,这些亚群经历广泛增殖和分化为各种类型的成熟血细胞。MPPs已经失去了自我更新的能力,但仍然可以多向分化。ST-HSC 则几乎是完全自我更新的,并且与成年小鼠造血维持的主要来源有关。

  在本研究中,作者使用流式细胞术分析了LSK、LT-HSC、ST-HSC和MPP的组分(图3,A-D)。结果显示,与对照组相比,PS-MNPLs治疗组降低了LSK和MPP的比例,并增加了LT-HSC和ST-HSC的比例。

  综合来看,NP-80组的集落形成能力最差,血液学指标差异显著。上述结果表明,MNPLs 处理改变了骨髓造血干细胞从静止到增殖的阶段,并减少了细胞集落形成。MNPLs体积越小,越容易穿透循环系统,破坏骨髓造血功能,进而影响外周血细胞的变化。ST-HSCs主要是重塑血池并维持造血功能,很少继续分化。MPP则由于各种原因分化为血小板、红细胞和白细胞,例如循环系统中的炎症或血管闭塞。

  早前已有研究证明肠道菌群失调是造血损伤的原因。作者使用16S rRNA测序对小鼠肠道微生物群进行分析。结果共得到504个OTU,对照组、10 MPs组、5 MPs组和80 NPs组的OTU分别为445、481、454和455个(图S3 A)。稀释性曲线证实测序数据量足以反映样本中的物种多样性(图S3 B)。通过Chao1和Shannon指数反映肠道微生物群落多样性(图S3 C,D)。β多样性由加权PCoA图揭示了治疗组和对照组的细菌结构聚类,其中点代表单个样本(图S3 E)。PERMANOVA(Adonis)分析结果显示,R2=0.333表明组间和组内无显著差异,P=0.0020.05表明试验具有较高的可信度(图S3 F)。这些结果表明,MNPLs可强烈影响肠道微生物群的多样性。

  分析结果展示了肠道微生物群在门和属水平的优势物种组成(图S4,A-D)。发现各组样本的肠道微生物群存在显著差异。厚壁菌门和拟杆菌门是最主要的优势菌门。在门水平上,与对照组相比,MNPLs处理组的拟杆菌显著富集(图S4 B)。在属水平上,MNPLs 治疗组和对照组之间共有 100 个属不同。

  基于以上结果,作者确认了MNPLs对造血系统造成损害。然而,其机制尚未明确。在本研究中,发现 NP-80对肠道菌群的影响远小于MP-10和MP-5。在肠道中,10μm的颗粒可能被保留在派亚氏集合淋巴结内,那些小于5μm的颗粒被M细胞运输到肠系膜淋巴结和外周淋巴器,而更小的80nm的颗粒会提高在体循环中的运输速度。

  肠道微生物群主要通过代谢物影响宿主健康。作者使用靶向代谢组学分析研究MNPLs 处理后血浆样品内源性代谢物的变化。成功地量化了样品中的 205 种代谢物,包括碳水化合物、氨基酸、有机酸、肉碱、脂肪酸、SCFAs 等(图S5 A)。PLS-DA 分析表明 MNPLs 处理组特异性代谢组学丰度和特征(图S5 B)。此外,在单变量检验P 0.05 和多维统计变量在投影分数 (VIP) 中的重要性 1个阈值,与对照组相比,MNPLs 治疗组分别获得了 22、37、29 种不同的代谢物作为潜在的生物标志物(图S5 C)。这些不同的代谢物主要集中在肉碱、脂肪酸、氨基酸、有机酸、胆汁酸、SCFAs 和咪唑类中(图S6 A,C,E)。这些差异代谢物中有10种对所有治疗组都是常见的:包括两种有机酸、四种脂肪酸和四种肉碱。使用 KEGG 进一步基于差异代谢物进行代谢途径富集。发现超长链脂肪酸的β氧化、丙酸代谢和脂肪酸生物合成是三个主要受影响的代谢途径。以上结果表明,MNPLs 处理呈现出特定的血浆代谢组。

  微生物群产生的代谢物会影响免疫功能。与对照组相比,六种细胞因子的血浆浓度显著改变(IL-10、IL-12p40、IL-17A、Eotaxin、MIP-1beta、IL-12p70)(图4)。IL-12p40和IL-10水平显著低于对照组。而三个MNPLs治疗组的Eotaxin浓度增加,IL-17A、MIP-1beta和IL-12p70均低于对照组。这些表明暴露于PS-MNPLs会引起炎症。其中,NP-80组的上述所有细胞因子均与对照组有显著差异。IL-12p40 和 IL-10 在所有组中均存在显著差异,表明它们可以作为 MNPLs 诱导细胞因子变化的重要标志物。

  分析了不同代谢物与造血指标的相关性(图5B),发现这些代谢物大部分与造血损伤指标显著相关。表明MNPLs诱导的代谢紊乱与造血损伤具有一定的相关性。

  在MP-10、MP-5和NP-80组中,与造血损伤指标显著相关的不同肠道菌群、代谢物和细胞因子的数量分别为5、11和0;3、25和 2;1、25和6(图5)。在 MP-10 组中,没有细胞因子与造血毒性显著相关;MP-5组的IL-17A和IL-10以及所有差异细胞因子与NP-80组的造血损伤指标显著相关(图5 C)。

  这些结果表明,MNPLs处理引起显著改变的菌群,代谢物和细胞因子与造血系统相关。

  8. MNPLs 诱导的造血系统中的肠道疾病、异常代谢和细胞因子改变之间的串扰

  图6显示了与造血损伤指标显着相关的肠道菌群、代谢物和细胞因子的相关分析。在MP-5和NP-80组中发现了互连轴,其中MP-5组中有Helicobacter_bilis、n-乙酰色氨酸和IL-10,NP-80组中有耳蜗形梭菌(Clostridium cocleatum)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、IL-12p40、和4-羟脯氨酸。然而,MP-10组没有相关轴,因为没有细胞因子与造血指标显著相关。结果表明,PS-MNPLs引起的肠道菌群紊乱可能通过调节代谢物质影响炎症因子,最终导致造血系统损伤。最近的研究结果表明,他们之间存在全面的串扰。例如,短链脂肪酸(SCFA)不仅是哺乳动物代谢的关键代谢物,还调节宿主免疫。Helicobacter_bilis是一种肠肝性幽门螺杆菌,可在一些近交系和远交系小鼠中引起肝炎、肝发育不良、纤维化等。n-乙酰色氨酸在预防肝脏缺血再灌注损伤中发挥作用。IL-10 调节肝细胞增殖和肝纤维化,IL-10缺乏会增加肾脏缺血再灌注损伤,或损害缺血心肌中骨髓来源的内皮祖细胞的存活和功能。4-羟脯氨酸有助于预防和治疗肥胖、心血管功能障碍和衰老相关疾病,以及抑制肿瘤发生和改善骨骼健康。TCDCA是胆汁酸的主要有效成分之一,通过TGR5受体在细胞凋亡和免疫反应中发挥关键作用。

  总而言之,血液毒性因PS-MNPLs颗粒大小而异,大小越小,血液毒性越大。更多的菌群、代谢物和细胞因子作为轴因子可能是参与PS-MNPLs诱导的造血损伤发展的关键标志物。进一步的研究仍需确定肠道微生物群多样性、代谢物组成和细胞因子浓度的变化是否有助于预测MNPLs引起的造血损伤。

  本研究为阐明PS-MNPLs与造血功能障碍之间的关系提供了证据。同时,发现肠道微生物群、代谢物和炎性细胞因子的破坏可能是PS-MNPLs诱导造血损伤的关键因素。此外,本研究结果为肠道微生物组、代谢组和炎症之间的相互作用提供了大量证据。这些与肠道微生物群代谢物炎症轴有关的因素可以作为探索MNPLs诱导造血毒性的诊断生物标志物,但相关的归因、方向性和纵向关联需要进一步探讨。